В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз.
Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы
Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток
Таблица 10. Функциональные свойства АЦС культуры Swiss3T3 клеток
Воздействия
Активность АЦ
(пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
Стимулирующий АЦ эффект в %
Базальная
30.59±1.41
100% (базальная)
NaF 10-2 М
178.91±4.15
585% (+485%)
форсколин 10-5 М
99.26±3.21
324% (+224%)
ГИДФ 10-6 М
111.20±3.48
364% (+264%)
ГТФ 10-5 М
82.98±2.92
271% (+171%)
ЭФР 10-9 М
168.31±4.75
550% (+450%)
ИФР-1 10-9 М
102.14±3.34
334% (+224%)
Инсулин 10-9 М
74.89±2.11
245% (+145%)
В скобках - активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в%), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100%, стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 10).
Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss 3T3 присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы.
Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры Swiss3T3 клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток Swiss3T3 митогенный эффект, оцениваемый по включению [14C]-тимидина в ДНК (Рис. 15-1). Показано, что инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) стимулировали синтез ДНК (прирост от 100% до 250%).
Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние (2,5 мин) на активность АЦ. (Рис. 15-2). Для подтверждения участия цАМФ в реализации митогенного эффекта был использован его дибутириловый аналог цАМФ, обладающий способностью проникать в клетку. Этот аналог, взятый при низких концентрациях (10-12-10-9 М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1. Эффект оценивали по включению [14C]-тимидина в ДНК (Рис. 15-3).
Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу (Перцева, 2000) об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митогенных процессов.
Участие аденилатциклазного сигнального механизм в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1
Нами подобрана модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям, вызывающим незапрограммированную гибель клеток (апоптоз). В экспериментах использовали культуру клеток E1A+cHa-ras, обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов («впадают в апоптоз») (Bulavin et al., 1999) и культуру клеток Е1А+Е1В с высокой устойчивостью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды («не впадают в апоптоз»). В клеточных культурах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 (Таблица 11).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий Е1А+сНа-ras и Е1А+Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 (10-8М) активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам. Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1 как в среде с 10% сывороткой, так и в среде с 0.5% сывороткой.
Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства - инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Показано, что инсулин (10-7М), ИФР-1 (10-8М) и дибутирил-цАМФ (10-9М) оказывают ингибирующее влияние на апоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток E1A+cHa-ras (Плеснева, 2003). Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры E1A+cHa-ras с использованием метода клоногенной выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных способов тестирования антиапоптотического действия агентов. Обнаружено, что культивирование
Таблица 11. Влияние инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток E1A+cHa-ras и E1A+E1B
Условия
Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка)
In vitro
E1A+cHa-ras
(клетки, впадающие в апоптоз)
Е1А+Е1В
(клетки, не впадающие в апоптоз)
Контроль
Инсулин
ИФР-1
Среда + 10% сыворотка
33.93.4
(100)
48.12.1
(142)
56.41.3
(166)
4.90.5
14.31.2
(292)
17.61
(359)
Среда + 0.5%
сыворотка (апоптоз)
95,93,4
137,09,0
(143)
181,68,2
(189)
26.70.5
61.41.2
(230)
86.32.1
(323)
In vivo
Среда +10%
сыворотка
4.10.29
6.00.9
(146)
12.20.5
(297)
5.20.3
8.51.0
(163)
11.41.3
(219)
11.01.2
17.21.2
(156)
24.82.2
(225)
5.80.6
10.00.7
(172)
13.60.6
(234)
Примечание. В опытах in vitro гормоны (10-8М) добавляли прямо в пробу, содержащую грубую мембранную фракцию клеток, для определения активности АЦ. Время инкубации 2.5 мин. В опытах in vivo инсулин (10-7М) и ИФР-1 (10-8М) добавляли к культурам клеток, время инкубации 5 мин. Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100%. Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды.
Трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве минимум в 2 раза, по сравнению с клетками, культивируемыми в нормальных условиях (среда+10% сыворотки).
Показано, что только 43% культуры клеток «выживают» в условиях, когда клетки впадают в апоптоз (среда +0.5% сыворотки) по сравнению с контролем (среда+10% сыворотка, принято за 100%). В экспериментах, когда в среду с 0,5% сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 70% (для инсулина: 77%, для ИФР-1: 67%, для дибутирил цАМФ: 66% по сравнению с контролем, принятым за 100%).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8