Примечание: В скобках - активность АЦ в%. Активность АЦ без пептидов принята за 100%.

Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют ?-субъединицы Gi и Gs белков.

Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование ?i-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Известно, что ??-димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-3-К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на ?i-субъединицу и ?? димер в условиях действия коклюшного токсина.

Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через ??-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.

Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности ?s-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1.

Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов, указывает на участие как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l.

Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1

Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин. Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10-9-10-7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 8). В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10-9-10-7М). Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10-7М (таблица 8). Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.

Таблица 8. Влияние вортманнина (10-9М-10-7М) на стимуляцию ИФР-1 (10-8М) и инсулином (10-8 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodonta cygnea

Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.

Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации). Этот факт указывает на участие ФИ-3-К в, обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.

Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС - кальфостин (Yoing et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как обнаружено нами, кальфостин (10-10-10-8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10-8М. В присутствии кальфостина (10-8М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (данные в диссертации).

Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКС?, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы.

Таблица 9. Влияние антител к ПКС? на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10-8М) и инсулина (10-8М) в мышечных мембранах крысы и моллюска A.cygnea

Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 100%.

Антитела к ПКС? почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9). Таким образом, использование моноклональных антител к ПКС? показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1. Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et а1., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКС? из мозга позвоночных.

Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (??-димер) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника - цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8