1.11.9. Определение серогрупповой принадлежности культур лептоспир проводят в соответствии с Наставлением по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток, утвержденным Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 31 мая 1974 г.
1.11.10. В качестве биологической модели для обнаружения лептоспир могут быть использованы взрослые кролики и морские свинки. Кровь животных исследуют по РМА на наличие специфических антител. Животных, в крови которых не обнаружены специфические антитела, заражают исследуемым материалом.
Кровь зараженных животных исследуют три раза через каждые семь дней по реакции микроагглютинации начиная с разведения 1: 10 с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение в крови зараженных животных специфических антител свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемом материале и позволяет ориентировочно судить о их серогрупповой принадлежности.
2. Бактериологическое исследование воды
2.1. Вода является основным фактором в передаче возбудителя лептоспироза.
Лептоспир обнаруживают в воде биологической пробой на крольчатах, свинках, хомяках, 'крапчатых сусликах, взрослых кроликах, используя одну из следующих методик.
2.2. Пробы воды объемом 1-2 л берут в стерильную посуду, подогревают до 30° и выливают в эмалированный кювет, - помещают в него на один час двух подопытных животных. кожа брюшка или задние ноги которых скарифицированы, так чтобы скарифицированная поверхность была погружена в воду. Начиная с четвертого дня у крупных зверьков (крольчата, морские свинки) берут кровь из сердца с целью выделения гемокультур, исследуют микроскопически брюшной экссудат. Одного из мелких зверьков убивают. На 14-20-й день всех выживших животных также убивают. Патологический материал исследуют на наличие лептоспир. Кровь исследуют на РМА.
2.3. Пробу воды (до 500 мл) центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 - минут, сливают надосадочную жидкость, а осадки из всех центрифужных стаканов суспензируют в стерильной - питательной среде для лептоспир или физиологическом растворе. Суспензию вводят внутрибрюшинно или подкожно хомякам по 0,5-1 мл, крольчатам и морским свинкам по 1-2 мл. В дальнейшем исследуют, как указано в п. 2.2.
2.4. Полученный после центрифугирования осадок подкожно вводят в дозе 2-3 мл взрослым кроликам, не имеющим в крови лептоспирозных антител,
Через 7-14 и 20 дней кровь кролика исследуют по РМА с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение специфических антител в титре 1: 10 и выше свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемой пробе воды.
3. Импрегнация гистологических срезов из органов серебром по левадити
3.1. Материалом для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени толщиной не более 1 см, консервированные 10%-ным раствором формалина.
Лептоспиры удается обнаружить с наибольшим постоянством в гистологических срезах импрегнированных серебром по Левадити. Методы Крантца, Полагута и Майера менее эффективны.
3.2 Несколько кусочков органов не толще 1 см, лучше 2-'3 мм, фиксируют в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина 24-48 часов. После фиксации кусочки переносят в 96° спирт на 24 часа. Промывают в дистиллированной воде до тех пор, пока кусочки не осядут на дно бюкса (не менее 2-3 часов), воду меняют три раза.
3.3. Помещают кусочки в 1-3%-ный раствор азотнокислого серебра на 3-6 дней. Процесс серебрения ведут при температуре 37 °С. Раствор азотнокислого серебра готовят на свежей дистиллированной воде из расчета 15 мл раствора на один кусочек.
3.4. Прополаскивают в дистиллированной воде в течение 2-5 минут. После промывки кусочки переносят в небольшую порцию редуцирующей смеси в отдельной чашечке на 2 минуты (раствор быстро темнеет) и затем помещают их в приготовленный перед употреблением основной редуцирующий раствор следующего состава: пирогалловая кислота - 4 г, дистиллированная вода - 100 мл, формалин чистый - 5 мл.
Раствор готовят из расчета 20-25 мл на один кусочек ткани. Восстановление обязательно проводят в банке из темного стекла.
3.5. Кусочки выдерживают в редуцирующей смеси 24-48 часов при комнатной температуре в темном месте или в банке из темного стекла.
Время выдержки контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12-16 часов во избежание передержания, так как срезы могут стать черными. Промывают в дистиллированной воде 1-2 часа.
3.6. Обрабатывают препараты последовательно спиртами: в 96° спирт (спирт 1) на сутки; в 96° спирт (спирт 2) на сутки; в 96° спирт (спирт 3) - на сутки; спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) - до опускания кусочков на дно бюкса, а затем в метилсалициловый - до утра.
3.7. После этого перекладывают в кашу-парафин (ксилол и парафин поровну) на 30 минут при 57°; парафин 1 - на 60 минут при 57 °С; парафин 2 - на 60 минут при 57 °С.
Из быстро остуженного парафина вырезают блок с кусочком органа и наклеивают на деревянный кубик. Приготавливают тонкие срезы на санном микротоме и наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10-15 минут в каждом и заключают под покровное стекло в канадский бальзам, подсушивают и просматривают под микроскопом со светлопольным конденсором при увеличении 90X7-10.
В случае неудовлетворительных результатов импрегнации лептоспир готовят препараты из других одновременно приготовленных блоков. Препараты необходимо хранить в темноте.
3.8. Микрокартина: лептоспиры черные, окружающая ткань буровато-желтая. Лептоспиры располагаются на поверхности эпителия и в просветах мочевых канальцев почек, несколько реже - в цитоплазме эпителия, преимущественно группами. После импрегнации серебром типичные лептоспиры имеют S-образную с 1-2 изгибами или змеевидную форму с грубыми, толстыми завитками, которые в отдельных случаях слабо заметны. Иногда в просвете и на поверхности эпителия мочевых канальцев встречаются аргирофильные гранулы (окрашены в цвет лептоспир), 'которые при отсутствии типичных форм нельзя принимать за лептоспир.
4. Серологическая диагностика лептоспироза
4.1. Серологическая диагностика лептоспироза основана на обнаружении специфических антител в крови животных, реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией микроагглютинации (РА).
4.2. Сыворотку крови животных исследуют на лепто-спироз по РМА или РА для выяснения благополучия хозяйства по этому заболеванию и установления диагноза на лептоспироз у отдельных животных.
В последнем случае проводят 2-3-кратное исследование. Кровь берут для исследования на 5-7-й день болезни и повторно через 7-10 дней.
4.1. Порядок постановки и учета реакции микроагглютинации (РМА)
4.1.1. Для постановки реакции микроагглютинации необходимы:
- исследуемая сыворотка крови животных;
- антигены - культуры диагностических штаммов лептоспир;
- электролит - физиологический раствор;
- микроскоп, конденсор темного поля и осветитель те же, что для микроскопической диагностики;
- агглютинационные пластинки или пробирки Флоринского;
- 40-100-гнездные штативы;
- бактериологические пробирки;
- градуированные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл;
- аппарат Флоринокого;
- предметные стекла.
4.1.2. Исследуемая сыворотка. Для исследования пригодна сыворотка свежая, замороженная, высушенная на фильтровальной бумаге, консервированная фенолом или борной кислотой. Консервируют отстоявшуюся сыворотку, слитую в сухие стерильные пробирки.
Добавляют 5%-ный раствор фенола при постоянном помешивании 0,05 мл (1 капля) на каждый миллилитр сыворотки.
Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.
Высушивают сыворотку на квадратах (5X5 см)' белой фильтровальной бумаги по 3-5 капель (0,05 мл каждая) при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С. Консервированные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. Гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют.
4.1.3. Антигены. В качестве антигенов в РМА используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. Республиканские лаборатории ставят реакцию с лептоспирами 13 серологических групп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola, Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi, Bataviae, Australis, Ballum.
Краевые, областные, межрайонные лаборатории исследуют сыворотку домашних животных с антигенами 6 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Hebdomadis, Canicola.
Сыворотку крови диких животных исследуют с лептоспирами 13-15 серогрупп.
В РМА используют эталонные штаммы лептоспир или их аналоги, рекомендованные Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов МСХ СССР.
Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР, и поддерживают их периодическими пересевами через каждые 10 -15 дней.
Пригодность культуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок в проходящем свете и микроскопией.
При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в проходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды - об отсутствии лептоспир.
В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5-15 дней без признаков агглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70-100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20X10X1,5 или 40X7-10. Культуры, содержащие 150-200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа, разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическим раствором до указанной концентрации.
Каждое разведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5-13 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в три лунки с разными разведениями сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 30 °С в течение часа.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
