14.2. Оборудование и реактивы

Аммиак водный (nh4ОН),ГОСТ 3760-64.

Калий железосинеродистый (феррицианнд калия, соль кровяная красная) ГОСТ 4206-65. Гепарин (25000 ед.).

Химические пробирки.

Пипетки на 1, 10 мл.

Фотоэлектроколориметр (ФЭК) с красным светофильтром.  

14.3. Ход определения и учет результатов

Для а налита у исследуемых рыб отбирают в пробирку 1 мл крови из сердца или хвостовой артерии. Кровь стабилизируют, добавляя в пробирку 2-3 капли раствора гепарина. У молоди рыб возможно групповое взятие крови (от 2 рыб и более).

При необходимости перевозки или хранения проб крови, закрытые пробками пробирки с кровью помещают в термос со льдом или в морозильную камеру холодильника с температурой - 12° С, кровь можно хранить в течение нескольких суток.

Перед исследованием кровь размораживают и тщательно перемешивают.

В две химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25 %-го раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой пробы (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка № 2) добавляют 1-2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, перемешивают содержимое пробирок и оставляют обе пробирки на 1 час. Через 1 час определяют величину оптической плотности (экстинцию) обоих растворов крови, в кюветах 10 мм при красном светофильтре, используя для сравнения 0,25 % -ный раствор аммиака.

В первой пробирке (пробирка № 1) определяют величину светопо-глощения раствора крови, с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина), во второй пробирке (пробирка № 2) - величину светопо-глощения раствора крови, в которой весь оксигемоглобин (Нв02) превращен в метгемоглобин (mthb).

Содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка № 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощеиил раствора метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина, то есть оксигемоглобина.

Определение светопоглощенил растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлекгроколориметре (ФЭКе) при красном светофильтре.

У ФЭКов различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭКа - 56 при работе с красным светофильтром № 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотометров ФЭК-56 ПМ и ФЭК КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 -670 нм,

Определение светопоглощения растворов крови проводят с использованием ФЭКов различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длины волн, используя для сравнения 0,25 %-ный раствор аммиака в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Различия, связанные с измерением экстинций растворов крови при различающихся длинах волн при работе на ФЭКах различных марок, корригируют путем введения в расчетную формулу коэффициента - величины приведенной экстинции раствора крови с исходным уровнем ок-сигемоглобина (ЕнвО2), как показано в разделе - расчет результатов анализа. При расчете этой приведенной величины используют измеренные опытным путем величины светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2)

- пробирка № 1; метгемоглобина (emthb) - пробирка № 2.

Предварительно опытным путем на молоди карповых рыб установлена средняя величина светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2) и средняя величина светопоглощения раствора крови с полученным уровнем метгемогдобина (ЕМthв).

Таким образом, найдено, что среднее значение плотности раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2) составляет 0,15, а метгемоглобина (emthb) - 0,77.

Поскольку гемоглобин в пробе крови рыб полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,62 (0,77-0,15) соответствует 100 % содержания метгемоглобина.

Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови рыб по данной методике.

По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови рыб с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка № 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка № 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенной формуле, используя установленный коэффициент и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн,

Х=(e2-e1) x 1,61 x 100, где:

Х - содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %; е2 - приведенное значение светопоглощения"раствора оксигемоглобина (ЕhвО2), расчет его приводится ниже е1 - среднее значение величины светопоглощения раствора оксигемоглобина, равное 0,15; 1,61 - расчетный коэффициенг, найденный из средних величин светопоглощения растворов оксигемоглобина и метгемоглобина, расчет его также приводится далее. Значение Е; - приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина

(ehbo2) находят из пропорции с использованием измеренных величин светопоглощения раствора оксигемоглобина (пробирка №1) и метге-моглобина (пробирка № 2) в опыте. e2     e4                      e3xe4 --- = -- откуда Е2=-------- , где:

e3     e5                          e5

Е2 - искомая величина - приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина - (ЕНвО2); Е3 - среднее (для рыб) значение оптической плотности раствора мет-гемоглобина, равное 0,77; Е4 - измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (пробирка № 1); e5 - измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина (пробирка № 2).Полученное значение Е2 подставляют в формулу для расчета содержания метгемоглобина в крови рыб.

Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (Е2) будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора оксигемоглобина (е1 = 0,15) (что объясняется индивидуальными колебаниями содержания гемоглобина в крови рыб), то содержание метгемоглобина будет равно или меньше 1,61 %.

Гематологические показатели рыб (физиологическая норма)

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5