3.2.2.2. Реакция агглютинации латекс-антигена (или антител) - РА-ЛАг (Зингер, Плотц, 1956).
Принцип метода. Реакция агглютинации мслкодисперсных частиц латекса, нагруженных: антигеном (АГ), под воздействием специфических антител (at) иммунной сыворотки или антителами, при взаимодействии с гомологичным АГ, применяется для обнаружения содержания антител у иммунных рыб к разным АГ и диагностики возбудителя болезни.
Компоненты и материалы. at - 5%-ный раствор растворимого антигена (в качестве источника АГ могут служить гомогенаты аутоантигс-нов, возбудителей болезни, вакцины, сыворотки крови и т.д.). Исследуемая сыворотка рыб. 10%-ная суспензия частиц полистиролового латекса стандартной величины-от 0,77 до 0,81 мкм на 0.65% растворе nacl. Хранят при 2-4° С, но не дольше 4-х недель. Разбавители: боратныи или глициновый буфер с рН 8,1-8,3. Боратный буфер: 50 мл 0,1 М раствора борной кислоты (6,184 г НзВОз растворяют в 1000 мл диет. воды), 5,9 мл 0,1%-ного раствора naoh и 100 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Глициновый буфер: к 1 л 0,1 М раствора глицина, доведенного до рН 8,2 с помощью 1 н. раствора naoh, добавляют 10 г nacl. Материалы: пипетки, пробирки, колбы и др.
Техника постановки реакции. Дм сенсибилизации частиц латекса к 0,1 мл 10%-ной суспензии мслкодиспсрсных частиц добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора АГ и 9,4 мл боратного буфера. Суспензию тщательно перемешивают и выдерживают 2 ч при 26°С. Постановку реакции латскс-аплютинации начинают с приготовления в дополнительном ряду пробирок разведении сыворотки исследуемых рыб на боратном буфере в соотношениях от 1:10, 1:20 до 1:1280- 1:2560.
Капельная реакция латекс-агглютинации. В ряд микропробирок вносят по 2 капли соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1 капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных соответствующим АГ. В контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведсниями инактивированной нормальной сыворотки. Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают при 26° С 30 мин. Затем смеси центрифугируют при 1500 об/мин в течение 3 мин, осторожно встряхивают н учитывают результат реакции.
Пробирочная реакция латекс-агглютинации. В опытный ряд пробирок приливают по 1 мл соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1 мл латскс-АГ. Контрольные смеси: 1) борат-ньш буфср+суспснзия латекс-АГ; 2) разведения нормальной сыворотки + суспензия латекс-АГ. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 26°С на 2 ч, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, осторожно встряхивают и учитывают результат реакции.
Учет и оценка результатов реакции производятся по образованию зерен латсксного агглютината и просветлению жидкости в пробирке. Учет результатов целесообразнее проводить в агглютиноскопе; оценка проводится по 4-балльной системе.
4. Определение напряженности иммунитета
Под напряженностью иммунитета следует понимать способность организма рыб противостоять агрессивному влиянию возбудителей болезни и их продуктам метаболизма и распада (экзо- или эндотоксинам). Напряженность иммунитета отражает совокупную деятельность всех функциональных структур иммунной системы рыб на уровне целостного организма. Одним из объективных способов оценки напряженности иммунитета или устойчивости рыб к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные болезни, является заражение рыб патогенными организмами или их токсинами. Оценка напряженности иммунитета применяется в селекционной работе, при определении эффективности вакцинации, последствий влияния благоприятных и неблагоприятных для жизнедеятельности биотических и абитических (включая токсические) факторов на выживаемость рыб.
4.1. Методика определения напряженности иммунитета (с ис- пользованием a.hydrophila)
4.1.1. Принцип метода основан на экспериментальном заражении рыб вирулентной культурой, вызывающей 50% или 10()%-нуто гибель исследуемого вида рыб. Причем, в группе рыб с низким уровнем естественной резистентности ld5o меньше, чем в группе рыб с более высоким уровнем напряженности естественного иммунитета.
4.1.2. Оборудование и реактивы: аквариумы, пробирки, шприцы, рыба, суточная культура вирулентных бактерий - возбудителя инфекционной болезни рыб.
4.1.3. Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Отбирают 60 экз. рыб, имеющих средний для данной партии рыб показатель навески. В заполненные водой (с температурой не ниже 18°С и не выше 26° С) пять (и более) аквариумов или бассейнов с аэрацией или садки, установленные в карантинном пруду, помещают по 25 экз. (из расчета не более 5 г ихтиомассы на 1 л воды) отобранных рыб, которым предварительно вводят внутрибрюшинно одномиллиардную взвесь суточной вирулентной культуры бактерий a. hydrophila, приготовленную на 0.65%-ном стерильном растворе натрия хлорида в дозах 0.125; 0.25; 0.5; 0.75; 1 мл (и более). Наблюдение за инфицированной рыбой ведут в течение 10 суток с момента инъекции микробной взвеси и по вьккивае-мости устанавливают дозу инфекта, вызывающую 50 или 100%-ную гибель рыб, с характерными для данной инспекции клиническими и патоло-гоанатомическими изменениями. Расчет летальной дозы, вызывающей 50%-ную гибель рыб (ld5o), проводят по методу Рида и Менча (Гончаров, 1973). Расчитанной дозой ld50 инфекта проводят заражение по 25 экз. исследуемых рыб, относящихся к одному виду, возрасту, с одинаковой массой, но находящихся при разных условиях содержания, либо на разных этапах иммуногеиеза, течения болезни и т.д. Постановку и проведение опыта, а также учет результатов осуществляют так же, как и при отработке дозы ld5o. Напряженность иммунитета определяют с учетом процента погибших рыб в опытной группе в сравнении с контролем. По окончании аквариумных опытов проводят обеззараживание воды в аквариумах путем создания в них 10%-ной концентрации формалина или 10%- ного раствора хлорной извести. Через час воду спускают в канализационную сеть, а рыб сжигают. Весь инвентарь и посуду, бывшие в употреблении при работе с больной рыбой, дезинфицируют в 10%-ном растворе формалина в течение часа. При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах, земляных садках, карантинных прудах рыбу сжигают и проводят дезинфекцию воды пугем хлорирования, доводя содержание свободного хлора в воде до 4-5 мг/л. Сутки спустя воду пропускают через известковый фильтр (используют только свежую негашеную известь). После этого проводят дезинфекцию ложа прудов или садков и бассейнов негашеной или хлорной известью и оставляют их без воды на срок не менее месяца. С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу Методические указания по определению уровней естественной резистентности организма рыб (к инфекционным болезням)", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 13.07.87 №432-3.
Приложение 1 к Методическим указаниям по определению уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб, утв. 25 ноября 1999 г.
Уровень фагоцитарной активности лейкоцитов карпа на стадии поглощения, %
Возраст рыб, время фагоцитоза с момен- та термостатирова-ния или введения
Объекта фагоцитоза
Низкий
Средний
Высокий
Процент фагоцитоза
Фагоцитарный индекс
Фаго-цитар-ный индекс
сеголетки
15 мин.
6,0+2,0
-
8,0+2,0
10 и
более
30 мин.
7,0+2,0
0,3+0,2
9,0+2,0
0,6+0,2
11-"-
0,7 и более
1 час
17,0+4,0
0,8±0,2
21,0+4,0
0,1+0,2
25 -"-
1,2-"-
1,5 часа
24,0+5,0
1,3+0,2
29,0+5,0
1,5+0,2
34 -"-
1.7-"-
2 часа
19,0+5,0
1,4+0,2
1,6+0,2
29 -"-
1,8-"-
двухлетки
9.0+3,0
12,0+3,0
15 -"-
13,0+5,0
18,0+5,0
0,5+0,2
23 -"-
0,7 -"-
20,0+7,0
0.9+0,2
27,0+7,0
1,1+0,2
1,3-"-
28,0+8,0
36,0+6,0
44.-"-
1,7-"-
27.0+8,0
35,0+8,0
43 -"-
трехлетки
9,0+3,0
15-"-
14,0+5,0
0,4+0,2
24 -"-
0,8 -"-
24,0+6,0
1,0+0,2
30,0+6,0
1,2+0,2
36 -"-
1,4-"-
30,0+s,0
1,2+0,4
38,0+8,0
1,6+0,4
46 -"-
2,0 -"-
28.0+8.0
1,4+0,3
36,0+8,0
1,7+0,3
44 -"-
4-8-летки
1 5 мин.
10,0+5,0
15,0+5,0
20 -".-
20,0+5,0
22,0+8,0
32,0+8,0
40 -"-
30,0+9,0
1,2+0-4
39,0+9,0
48 -"-
29,0+9,0
38,0+9,0
47 -"-
2,0-"-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
