Тварин оперували під комбінованим дом'язовим наркозом. Виконували повздовжню ентеротомію (1,5-2,0 см). Рану кишки або залишали відкритою, або зашивали вузловими серозно-м'язовими однорядними повздовжніми швами [Мазур Ю. І., 1996].
Донорами ембріональних тканин і клітин слугували ембріони самки кроля кінця другого - початку третього тижня вагітності. З черевної стінки ембріона сепарували препарати шкіри та м'язово-очеревинного пласту, котрий у подальшому умовно називали очеревиною. Препарати діаметром 1,5-2,0 см фіксували швами поверх рани тонкої кишки.
Для виділення остеобластів використовували росткові зони трубчатих кісток кінцівок трьохтижневого ембріона кроля. Під мікроскопом МБИ-6 при чотирьохразовому збільшенні в умовах темного поля локалізували росткові зони кісток і висікали їх [Созанский О.А. и др., 1998]. Одержаний матеріал гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при 200 об/хв у трьох вертикальних ходах. Для одномоментної трансплантації використовували 200-300 мг клітинної суспензії [Дибас Б.В., 1996].
У подальшому досліджували препарати отримані з ембріональних тканин (очеревина, шкіра) та клітин (остеобласти) до та після алотрансплантації, а також препарати отримані з тонкої кишки реціпієта.
Виділення мітохондріальної та цитоплазматичної фракції здійснювали за методикою диференційного центрифугування [Johnson D., Lardy H.,1967].
Активність лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), сукцинатдегідрогенази (СДГ, КФ 1.3.99) визначали методом [Eщенко Н.Д., 1982], малатдегідрогенази (МДГ, КФ 1.1.1.37) - згідно [Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г., 1982], глюкозо - 6 - фосфатдегідрогенази (Гл -6- ФДГ, КФ 1.1.1.49) - згідно [Путилин Ф.Е., Зоидзе С.Д., 1982], визначення активності кислої фосфатази (КФ, КФ 3.1.3.2) проводили з використанням стандартних наборів реактивів „LACHEMA” (Чехія).
Визначення кількості піровиноградної кислоти в тканинах здійснювали за методом [Czok R., Lamprecht W., 1970]. Вміст молочної кислоти в тканинах визначали згідно з [Hohorst H., 1970].
Гістологічні препарати забарвлювали гематоксилін-еозином за загальноприйнятою методикою [Ромейс В., 1953] й вивчали під світловим мікроскопом.
Статистичну обробку результатів досліджень проводили згідно зі загальноприйнятими методами варійційної статистики за допомогою пакету прикладних програм STATGRAFICS, а також з використанням факторного та кластерного аналізу [Харман Г., 1972, Лакин Г.Ф., 1990].
Результати досліджень та їх обговорення
Морфологічна характеристика вільно алотрансплантованих ембріональних тканин. Внаслідок трансплантації ембріональних тканин в організмі реціпієнта виникає реакція на трансплантат, однак вона маловиражена й перебігає дуже повільно. Імунна реакція на трансплантацію ембріональних тканин не має характерних ознак реакції відторгнення трансплантата, інтенсивність її не залежить від виду пересадженої тканини, морфологічними проявами її є лімфоїдна інфільтрація пересадженої тканини з повнокрів'ям судин.
Після трансплантації ембріональна очеревина з третьої доби набуває сполучнотканинної будови. У трансплантаті протягом двох тижнів спостерігається значне зменшення кількості лімфоїдних елементів та повнокрів'я. Наприкінці 3-го місяця трансплантат має вигляд ледь помітної смужки й побудований зі сполучної та прошарку жирової тканини, частково з'єднаної зі стінкою кишки.
У випадку трансплантації ембріональної шкіри трансплантат з ранніх термінів спостереження має будову, що в цілому відповідає будові шкіри - зроговілий епітелій, волосяні фолікули. Сполучнотканинна основа пересадженої шкіри побудована з молодої грануляційної тканини. Характерними є крововиливи, лімфоїдна інфільтрація.
Протягом усього терміну дослідження після операції спостерігаються послідовні ознаки очищення сполучної тканини трансплантата, багатої на клітини фібробластичного ряду, від лейкоцитарної та еритроцитарної інфільтрації, перетворення зачатків і сформованих волосяних фолікулів у дрібні рогові кісти. Через 6 місяців після операції трансплантат має вигляд тонкого прошарку повнокровної сполучної тканини або повністю заміщується жировою тканиною.
Морфо-функціональні особливості ембріональних трансплантатів зберігаються обмежений проміжок часу, а відтак пересаджені тканини поступово заміщуються сполучною чи жировою тканиною.
Характеристика процесів енергозабезпечення ембріональних тканин і клітин. Встановлено, що гліколіз найбільш інтенсивно протікає в ембріональній очеревині. Серед досліджуваних ембріональних об'єктів для ембріональної очеревини характерна висока активність ЛДГ (рис. 1) і значний вміст пірувату та лактату.
Активність ферментів циклу трикарбонових кислот (ЦТК) є найвищою в ембріональних остеобластах. Показники активності цитоплазматичної малатдегідрогенази (МДГ (ц)) (42,74±3,28 мкмоль НАДН/хв · мг білка) та мітохондріальної малатдегідрогенази (МДГ(м)) (38,93 ± 5,64 мкмоль НАДН/хв · мг білка) перевищують показники активності цих ферментів, які складають відповідно 30,7 ± 2,1 та 40,67 ± 2,74 мкмоль НАДН/хв · мг білка у досліджуваних препаратах ембріональної очеревини; відповідно 24,13 ± 2,22 та 23,65 ± 1,85 мкмоль НАДН/хв · мг білка у препаратах ембріональної шкіри.
Для ембріональної шкіри характерна висока (порівняно з іншими ембріональними об'єктами) активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Гл-6-фДГ).
Для ембріональної очеревини, на відміну від ембріональної шкіри, притаманні вищі показники активності ферментів, що може характеризувати процеси як гліколізу, так і ЦТК при незначній активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази - регуляторного ферменту пентозофосфатного шляху. Оскільки ембріональна очеревина - мало диференційована тканина, то, імовірно, високі потенційні можливості реалізуються в подальшій диференціації тканини. Підвищення активності ферментів гліколізу та ЦТК в ембріональних остеобластах може бути пояснена значною енергоємністю пластичних процесів, що протікають в ембріональній кістці (розвиток і ріст кісткової тканини потребують великих енергетичних витрат).
Особливості енергозабезпечення ембріональних тканин після трансплантації. Протікання метаболічних процесів у препаратах тонкої кишки після ентеротомії в ранньому післяопераційному періоді супроводжується значним підвищенням активності ферментів ЦТК - на 3-ю добу активність МДГ(ц) зростає в середньому в 8,5 раза, МДГ(м) - у 3 рази та сукцинатдегідрогенази (СДГ) майже у в 2 рази (рис. 3, 4).
Одночасно, майже в 4 рази зменшується кількість пірувату та падає рівень лактату. Активність лактатдегідрогенази достовірно зростає, і становить 28,98 ± 1,44 мкмоль НАДН/хв.мг білка (р?0,05). При цьому активність Гл-6-фДГ - ферменту окислювальної стадії пентозофосфатного шляху значно знижується впродовж 7-и днів після ентеротомії.
На 7-у добу після операції, за умов розвитку адаптаційно-компенсаторних реакцій спрямованих на поступове відновлення метаболізму клітини, рівень показників, що характеризують активність МДГ, повертається до вихідних величин. Водночас активність СДГ, ЛДГ та Гл- 6- фДГ - на 14-ту добу після операції перевищує контрольні значення.
При дослідженні показників енергообміну ембріональних шкіри, очеревини та остеобластів після алотрансплантації зрілому реціпієнту встановлено, що на третю добу після трансплантації ембріональної очеревини в пересадженій тканині знижується активність ЛДГ (у середньому на 33%), зменшується вміст метаболітів гліколізу (пірувату, лактату в тканині та крові), що може свідчити про інгібування процесів анаеробного гліколізу. Активність МДГ(м) знижується (у середньому на 49%) відносно вихідних показників ембріональної тканини, та відносно контрольних показників тонкої кишки (у середньому на 23%), активність МДГ(ц) зменшується відносно вихідної активності інтактної ембріональної тканини (у середньому на 46%), а активність СДГ достовірно зростає.
У перші три доби в умовах раннього післяопераційного періоду, за вираженої тканинної ішемії, активуються біосинтетичні процеси - спостерігається зростання (відносно вихідної активності інтактної ембріональної тканини), у середньому майже у 2 рази активності Гл- 6- ФДГ.
Через тиждень після алотрансплантації рівень досліджуваних показників енергообміну пересадженої тканини відповідає показникам притаманним для інтактної ембріональної очеревини.
Таким чином, протягом 7-ми діб, незважаючи на явища тканинної ішемії, які мали місце в ранньому післяопераційному періоді, відновилася її вихідна функціональна активність.
На третю добу після алотрансплантаціі ембріональної шкіри зменшується активність ферментів ЦТК, водночас зменшується, порівняно з інтактною ембріональною тканиною, (у середньому на 20%) активність ЛДГ, рівень пірувату залишається без змін, що характеризує стан тканинної ішемії.
Через тиждень після трансплантації ембріональної шкіри спостерігається подібна (як і для ембріональної очеревини) динаміка в змінах активності ферментів ЦТК; одночасно зростає рівень пірувату та лактату в крові. Проте, зміни у величинах досліджуваних показників менш виражені в порівнянні з ембріональною очеревиною.
У пізніші терміни спостереження зміни показників гліколізу, циклу трикарбонових кислот, пентозофосфатного шляху характеризуються подібністю: зростання на 7-му, з наступним зменшенням на 14-ту добу.
Через місяць після трансплантації ембріональних тканин, характерно наступне: кількість пірувату й лактату в тканині стабілізується й утримується на одному рівні, хоча показники дещо нижчі від контрольних показників тонкої кишки. У той же час активність ЛДГ змінюється - незначно зростає на 30-ту добу, падає на 60-ту й знову зростає на 90-ту добу спостереження (рис. 8). Регенераційні процеси, як і більшість метаболічних процесів у біологічних системах, мають фазовий характер.
Одночасно спостерігається ініціювання циклу трикарбонових кислот, активність ферментів якого зростає.
Встановлена динаміка змін досліджуваних показників характеризує особливості метаболізму, які виникають у зв'язку з морфологічною трансформацією пересаджених тканин, і, мабуть, втратою ними характерних для ембріональних тканин як структурних, так і метаболічних особливостей.
Особливості метаболічних процесів вільно алотрансплантованих ембріональних остеобластів. При вільній алотрансплантації ембріональних остеобластів пересаджені клітини опиняються в ситуації зумовленій ізольованістю трансплантата від оточуючих тканин, оскільки реваскуляризація неокістки здійснюється кістковою тканиною реціпієнта. Відсутність повноцінного судинного зв'язку з оточуючою тканиною визначає, по-перше, певну незалежність метаболічних процесів, по-друге, тканинну ішемію трансплантованих клітин.
Страницы: 1, 2, 3, 4
